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Automatisierte Mikroskopie und Zellzählung
Wir haben ein Bildaufnahme- und Auswertesystem zur automatischen, mikroskopischen Auswertung vergleichsweise einfacher Proben entwickelt. Die Anwendung liegt z. B. in der Zählung von in Lösung befindlichen Bakterienzellen, welche auf Filtermembranen filtriert und immobilisiert sind.
Das System ist in der Lage, Bildausschnitte schlechter Qualität bzw. mit ungenügendem Fokus bereits vor der Auswertung automatisiert und ohne Nutzerinteraktion von der weiteren Bearbeitung mit einer hohen Zuverlässigkeit (>95 %) auszuschließen. Es können pro Tag bis 50 FISH-gefärbte Proben jeweils mit bis zu 2000-3000 gezählten Zellen bearbeitet werden.
Es besteht aus zwei Modulen:
Das erste Modul MPISYS (gelb) erlaubt das automatisierte Erkennen der Proben (in diesem Fall Filterstückchen mit Planktonproben auf Objektträgern) und die anschließende automatische Aufnahme entsprechender mikroskopischer Bildserien.
Das zweite Modul ACMEtool (blau) dient der Zellzählung auf den von MPISYS gemachten mikroskopischen Bildern. Eine manuelle Beurteilung der Bilder und die Einstellung der Zählparameter ermöglichen eine hohe Zählgenauigkeit.
Instrumente
- Zeiss Axioimager.Z2m
Vollmotorisiertes und softwaregesteuertes Mikroskop für automatisierte Hochdurchsatz-Zellzählungen sowie zur Erstellung von Übersichtsaufnahmen ganzer oder teilweiser Objektträger.
Konfigurationen
2020-heute:
- motorischer Mikroskoptisch für bis zu 8 Objektträger mit Piezoantrieb
- mikroskopische Bildaufnahme mit Zeiss Kamera AxioCam 702 mono, MRm oder MRc5
- LED-Beleuchtungssystem (Zeiss Colibri 7) für schnelle Wechsel zwischen den Fluoreszenzkanälen (385, 469, 555 oder 590, und 631 nm) in Kombination mit einem Multibandfilter
- Übersichtsbildaufnahme ganzer Objektträger mit 1x Objektiv
- Windwos 10 und 64bit Upgrade der Programmierung
Die Systemsteuerung erfolgt über Zeiss AxioVision auf Basis von Entwicklungen und Methoden von Zeder et al., 2006-2011, sowie Bennke et al., 2016.
2006-2019:
- motorischer Mikroskoptisch für bis zu 8 Objektträger mit Piezoantrieb
- mikroskopische Bildaufnahme mit Zeiss Kamera AxioCam MRm oder MRc5
- LED-Beleuchtungssystem (Zeiss Colibri) für schnelle Wechsel zwischen den Fluoreszenzkanälen (365, 470 und 590 nm) in Kombination mit einem Multibandfilter
- HXP 120 Beleuchtungssystem mit zugehörigen Filtersets für diejenigen Fluoreszenzkanäle, welche nicht von der LED abgedeckt werden, wie z. B. Cy3 oder Cy5
- Übersichtsbildaufnahme ganzer Objektträger mit 1x Objektiv
- Übersichtsbildaufnahmen von Teilbereichen mit jedem vorhandenen Objektiv
Die Systemsteuerung erfolgt über Zeiss AxioVision auf Basis von Entwicklungen und Methoden von Zeder et al., 2006-2011.
- Zeiss Axioplan 2
Automatisiertes Hochdurchsatz-Zellzählsystem für die Analyse an Bord von Forschungsschiffen
Konfigurationen
2020-heute: LED, Kamera und Software-Upgrade
- motorischer Mikroskoptisch Märzhäuser EK 14 für bis zu 2 Objektträger
- mikroskopische Bildaufnahme mit Zeiss Kamera AxioCam 702
- Übersichtsbildaufnahme ganzer Objektträger mit Logitech 905 C Webcam
- LED-Beleuchtungssystem (Zeiss Colibri 7) für schnelle Wechsel zwischen den Fluoreszenzkanälen (385, 469, 555 oder 590, und 631 nm) in Kombination mit einem Multibandfilter
- Systemsteuerung über Zeiss AxioVision auf Basis von Entwicklungen und Methoden von Zeder et al., 2006-2011, sowie Bennke et al., 2016
- Windwos 10 und 64bit Upgrade der Programmierung
2015-2019: weitere Optimierungen für den Einsatz an Bord von Forschungsschiffen
- motorischer Mikroskoptisch Märzhäuser EK 14 für bis zu 2 Objektträger
- mikroskopische Bildaufnahme mit Zeiss Kamera AxioCam MRm oder MRc
- Übersichtsbildaufnahme ganzer Objektträger mit Logitech 905 C Webcam
- 3-Kanal LED-Beleuchtungssystem Rapp Opto KSL 70 Fluoreszenzkanälen (365, 470, und 590 nm)
- Systemsteuerung über Zeiss AxioVision auf Basis von Entwicklungen und Methoden von Zeder et al., 2006-2011, sowie Bennke et al., 2016
Das System wurde auf den seegehenden Forschungsausfahrten UltraPac (SO 245) in 2015/16 und der Arktisausfahrt (MSM 56) in 2016 erfolgreich eingesetzt.
2012-2014: Das System und die Programmierung wurde für den Einsatz an Bord von Forschungsschiffen angepasst
- motorischer Mikroskoptisch Märzhäuser/Kontron für bis zu 4 Objektträger
- mikroskopische Bildaufnahme mit Kamera Hamamatsu ORCA
- Übersichtsbildaufnahme ganzer Objektträger mit Logitech 905 C Webcam
- 3-Kanal LED-Beleuchtungssystem Rapp Opto KSL 70 Fluoreszenzkanälen (365, 470, und 590 nm)
- Systemsteuerung über Zeiss AxioVision auf Basis von Entwicklungen und Methoden von Zeder et al., 2006-2011, sowie Bennke et al., 2016
Das System wurde 2012 erfolgreich auf der seegehenden Forschungsausfahrt Atlantic Meridional Transect (AMT 22) eingesetzt.
2002-2011: Ursprüngliche Konfiguration für den Laboreinsatz entsprechend der Veröffentlichung von Pernthaler et al., 2003
- motorischer Mikroskoptisch Märzhäuser/Kontron für bis zu 4 Objektträger
- mikroskopische Bildaufnahme mit Kamera Hamamatsu ORCA
- klassische Fluoreszenzbeleuchtung mit Hochdruckquecksilberdampflampe (Zeiss HBO 100) und optischen Filtern für zwei Fluoreszenzkanäle
- Systemsteuerung über Zeiss KS400
Software
- Automatisierte Zellzählung (ACMEtool)
Die automatische Zellzählung auf Mikroskopbildern erfolgt mit der Software ACMEtool.
ACMEtool (Automated Cell Measuring and Enumeration Tool) wurde von M. Zeder entwickelt (www.technobiology.ch).
Das Programm ermöglicht die parallele Bildanalyse von mehreren Fluoreszenzkanälen und wurde für die Analyse von mit FISH und DAPI gefärbten Bakterienzellen aus filtrierten Wasserproben entwickelt. Es kann sowohl für einfache Zellzählungen als auch für komplexe Experimente verwendet werden, wie z. B. Mikroautoradiographie in Kombination mit FISH oder geneFISH. Es liefert Werte zur Morphologie und Signalstärke und kann auch für andere Objekte angepasst werden.
Das Programm benötigt Graustufenbilder (8 bit) mit einem speziellen Datei-Namenschema, welches in der ersten Videoanleitung erklärt wird.
Seit 2018 übernimmt das MPI Bremen die Fortführung der Softwareentwicklung und Fehlerbehebung.
Das Programm ist für nichtkommerzielle Zwecke frei verfügbar. Die Nutzung erfolgt auf eigenes Risiko. Es wird keinerlei Gewährleistung in irgendeiner Art und Weise übernommen und es gibt keine Garantie für die Richtigkeit der erzeugten Ergebnisse. Für Fragen wenden Sie sich bitte an: A. Ellrott
Software download:
Installation: Entpacken und kopieren Sie den kompletten ACMEtool3-Ordner auf Ihre lokale Festplatte und öffnen Sie die Anwendungsdatei „ACMEtool3_2021-04-02“. Normalerweise ist keine weitere Installation nötig, da das benötigte Microsoft Net Framework 4.7.2 üblicherweise schon auf den meisten aktuellen Rechnern vorhanden ist.
Referenz – um ACMEtool zu zitieren, nutzen Sie bitte:
Bennke, Christin M., Greta Reintjes, Martha Schattenhofer, Andreas Ellrott, Jörg Wulf, Michael Zeder, and Bernhard M. Fuchs. 2016. ‘Modification of a High-Throughput Automatic Microbial Cell Enumeration System for Shipboard Analyses’. Applied and Environmental Microbiology 82 (11): 3289–96. https://doi.org/10.1128/AEM.03931-15.
- Übersichtsbildaufnahme von Objektträgern mit Web-Kamera
Eigenentwicklung eines Systems zur Übersichtsbildaufnahme ganzer Objektträger mittels Web-Kamera.
Ergänzendes Material zur Veröffentlichung von Zeder et al., 2011.
Beschreibung und Download der Software:
Systemübersicht mit Beschreibung der Hardware und Software. Anleitung für Einrichtung und Kalibrierung.
- Gerätetreiber für MCP4 Tischsteuerung
Unser altes Axioplan 2 verfügt über einen Märzhäuser Mikroskoptisch, angesteuert von einer Zeiss MCP4-Steuerung von Kontron. Diese wurde für die veraltete Zeiss KS400-Software entwickelt und wird von neuerer Software, wie z. B. Zeiss AxioVision, nicht mehr unterstützt. Die einzige Möglichkeit, diese Tischsteuerung unter AxioVision VBA ansprechen zu können, war die Programmierung eines entsprechenden Treibers.
Wir stellen hier eine dll zur Verfügung, welche alle Funktionen enthält, einen Mikroskoptisch über die MCP4-Steuerung von Kontron anzusprechen.
Nach Registrierung der dll im Betriebssystem und Referenzierung im VBA-Modul von AxioVision stehen die Funktionen in der AxioVision VBA-Programmierumgebung zur Verfügung.
Referenzen
- Alonso C., Zeder M., Piccini C., Conde D., Pernthaler J. 2009. Ecophysiological differences of betaproteobacterial populations in two hydrochemically distinct compartments of a subtropical lagoon. Environ. Microbiol. 11:867-876. [PMID:19040452]
- Bennke C.M., Reintjes G., Schattenhofer M., Ellrott A., Wulf J., Zeder M., Fuchs B.M. 2016. Modification of a High-Throughput Automatic Microbial Cell Enumeration System for Shipboard Analyses. Appl. Environ. Microbiol. 82:3289-96. [PMID:27016562]
- Pernthaler J., Pernthaler A., Amann R. 2003. Automated enumeration of groups of marine picoplankton after fluorescence in situ hybridizationMicrobiol. 69:2631-2637. [PMID:12732531]
- Salcher M.M., Pernthaler J., Zeder M., Psenner R., Posch T. 2008. Spatio-temporal niche separation of planktonic Betaproteobacteria in an oligo-mesotrophic lake. Environ. Microbiol. 10:2074-2086. [PMID:18430016]
- Schattenhofer M., Fuchs B.M., Amann R., Zubkov M.V., Tarran G.A., Pernthaler J. 2009. Latitudinal distribution of prokaryotic picoplankton populations in the Atlantic Ocean. Environ. Microbiol. 11:2078-2093. [PMID:19453607]
- Zeder M., Ellrott A., Amann R. 2011. Automated sample area definition for high-throughput microscopy. Cytometry A. 79:306-310. [PMID:21412981]
- Zeder M., Kohler E., Pernthaler J. 2010. Automated quality assessment of autonomously acquired microscopic images of fluorescently stained bacteria. Cytometry A. 77:76-85. [PMID:19821518]
- Zeder M., Pernthaler J. 2009. Multispot live-image autofocusing for high-throughput microscopy of fluorescently stained bacteria. Cytometry A. 75:781-788. [PMID:19658173]
- Zeder M., Peter S., Shabarova T., Pernthaler J. 2009. A small population of planktonic Flavobacteria with disproportionally high growth during the spring phytoplankton bloom in a prealpine lake. Environ. Microbiol. 11:2676-2686. [PMID:19601962]
- Zeder M., van den Wyngaert S., Köster O., Felder K.M., Pernthaler J. 2010. Automated quantification and sizing of unbranched filamentous cyanobacteria by model-based object-oriented image analysis. Appl. Environ. Microbiol. 76:1615-1622. [PMID:20048059]